Det handlar om realtidsmätare för mikrobiell vattenkvalitet. Forskarna har använt en känslig, kontinuerlig, fluorescenssensor i kombination med maskininlärning för att förutsäga om allvarlig fekal kontaminering i vatten förekommer.
Av: Kennet M Persson
E.coli är den enskilt viktigaste indikatororganismen som används för att bedöma mikrobiell kvalitet i dricksvatten, men E.coli behöver odlas för att något klarlägga eventuell förekomst och för att ge en indikation om vilken risk som föreligger vid användning av vattnet. WHO har grupperat risken för fekal kontaminering i dricksvatten relaterat till E. coli-koncentrationen. Man definierar fyra riskkategorier: låg (1–9 CFU/100 ml), mellan (10–99 CFU/100 ml), hög (100–999) CFU/100 ml) och mycket hög (1000 CFU/100 ml).
En gammal önskedröm i dricksvattensammanhang är att kunna mäta mikrobiell kvalitet i realtid och få signal om någon störning skett i råvattnet, beredningen eller i ledningsnätet. På så sätt skulle operatören kunna reagera och åtgärda eventuell smittspridning innan den hunnit nå förbrukaren. De senaste tio årens utveckling inom området mikrobiell övervakning har lett till att det inte längre bara är en önskedröm, utan kanske börjar bli en möjlighet också på riktigt.
Utvecklingen inom flödescytometrin där cellräkning och korrelation mot oliklånga DNA-prov ger vissa löften om att det kommer att gå att mäta bakteriehalter och tolka vad de berättar om smittspridning i nära realtid. Mätningar av fluorescens i vattenprov är ett annat lovande område, där dataregistren OpenFluor och PARAFAC erbjuder mängder med konstgjorda och naturliga organiska ämnens fluorescensspektrogram för användarna. Fluorescens sker när molekyler bringas att absorbera energi i ett visst våglängdsområde för att emittera den i ett annat. Olika molekylslag absorberar och emitterar vid olika våglängd. Absorptions-emissions-spektrogrammet kan på så sätt ses som ett fingeravtryck av vilka ämnen som förekommer i provet.
Aminosyran tryptofan har ett karaktäristiskt spektrogram och i senaste numret av Water Research skriver Emily Bedell och medarbetare om sina studier av en känslig, kontinuerlig, fluorescenssensor de använt i kombination med maskininlärning för att förutsäga om allvarlig fekal kontaminering i vatten förekommer, vilket av forskarna definieras som >10 kolonibildande enheter (CFU)/100ml E. coli, (Bedell et al., 2022).
Tryptofan innehåller en amingrupp, en karboxylsyragrupp och en sidokedjeindolgrupp. Indoldelen tillåter tryptofan att fluorescera, vilket gör den till en av tre kända aminosyror (utöver tyrosin och fenylalanin) med denna egenskap. Tryptofanliknande fluorescens (TLF) kallas ibland också Peak T1, eller T1-toppen. TLF har en excitationsvåglängd på 275 nm och en emissionsvåglängd runt 360 nm. Det är känt att TLF kan korrelera med E. coli i grundvatten och ytvatten. Förekomst av TLF i vatten kan indikera att tryptofan är närvarande ensamt som löst molekyl eller bundet i proteiner, peptider eller humusstrukturer där mikrobiell aktivitet förekommer. TLF kan mätas både för tryptofan inne i celler och för tryptofanrester utanför celler. Den intracellulära och/eller extracellulära naturen hos TLF verkar bero på typen och källan till vattnet.
Tidigare studier har visat att TLF förekommer i grundvatten som extracellulärt material, medan mätningar på odlade bakterier i laboratorium gav dominerande svar för det intracellulära materialet, dvs. de intakta bakterierna. Yttre förhållanden, som förekomst av andra organiska föreningar i vatten, temperatur, pH och turbiditet påverkar mätnoggrannhet och signalsvar. Mikrobiell påväxt på sensorn, kemiska utfällningar som kalk respektive eventuella elektriska avvikelser med baslinjedrift i signalen behöver också hanteras. Men det finns flera känsliga, bärbara TLF-sensorer på marknaden och om dessa utrustas med maskininlärning mot kända förhållanden och kalibreras mot E.coli-halter som svarar mot TLF-sensorns signal börjar det bli möjligt att använda fluorescens för att i realtid mäta förekomst av E.coli i vatten.
Forskarna tog kalibreringskurvor för L- tryptofan i vatten i laboratorium vid olika temperaturförhållanden för att klarlägga detektionsgräns och sensorns signalstabilitet. Man tog vattenprover från avloppsreningsverket i Boulder med olika halt E.coli för att få bestämma sensorns känslighet och specificitet. Därefter byggdes fyra sensorier för TLF-mätning och sattes i fält längds ett vattendrag vid Boulder, Colorado. Mätkampanjen pågick under sommaren 2021 med TLF-mätningar och frekvent kontroll av förekomst av E.coli i vattendraget genom att stickprov togs vid upprepade tillfällen och odlades i laboratorium för att bestämma den faktiska E.coli-halten i provvattnet. TLF-sensorerna skickade mätdata via mobilnätet till en databas där TLF-värdena lagrades. TLF-mätningarna korrelerades därpå mot uppmätta E.coli-halter och utvärderades med hjälp av statistisk analys av en maskininlärningsalgoritm.
När arbetet utvärderades visade det sig att sensorns lägsta detektionsgräns (LDG) för tryptofan löst i avjoniserat vatten var 0,05 ppb (p <0,01) och dess LDG för korrelationen till E. coli i naturvatten var 10 CFU/100 ml (p <0,01). Fluorescenssvaret minskade exponentiellt med ökad vattentemperatur och en korrektionsfaktor beräknades som kunde inlemmas i maskininlärningsalgoritmen. Mikrobiell påväxt på TLF-sensorerna ökade fluorescenssignalen med cirka 82 % under vissa förhållanden. Kemisk utfällning minskade sensorns känslighet med cirka 5 % efter 24 timmar om TLF-sensorn utsattes för kraftigt förhöjda kalicumkarbonathalter.
Maskininlärningsmodellen utvecklades med hjälp av statistikprogrammet R, med TLF-mätningar som den grundläggande mätparametern vid bedömning av risknivåer enligt WHO:s skala vid misstänkt fekal kontaminering. Såväl specificitet som känslighet räckte till för att med hjälp av TLF-mätningar i naturvatten kunna placera dem i någon av WHO:s riskkategorier, men inte för att ange exakt antal bakterier. Den sammanlagda noggrannheten för att förutsäga hög risk för fekal kontaminering var 83 % (95 % KI: 78 % – 87 %), där känsligheten var 80 % och specificitet 86 %. Om halterna E.coli var lägre minskade noggrannheten och för alla WHO:s riskkategorier klarade TLF-sensorn att ge en total noggrannhet på 64 %.
Sensorn behövde viss skötsel, framför allt regelbunden rengörning, eftersom påväxt av biofilm störde TLF-mätningarna.
Slutsatser
Forskarna redovisar i sin artikel en ambition att ta fram en TLF-sensor som kan användas i hushåll med egen brunn, där den mikrobiella kontrollen görs sällan eller kanske aldrig. En sensor samlar mätdata i hushållet och skickar via mobilnätet till en central där maskininlärningsalgoritmer och riskbedömningar görs löpande. Med hjälp av SMS-meddelande kan en varning skickas till hushållet om risken för fekal kontaminering överstiger en viss nivå. Denna typ av övervakning i realtid ger betydligt snabbare återkoppling för användarna och säkrare dricksvattenförsörjning. Vi är ett steg närmare en realtidsmätare för mikrobiell kvalitet.
Källa: Emily Bedell, Olivia Harmon, Katie Fankhauser, Zack Shivers, Evan Thomas,
A continuous, in-situ, near-time fluorescence sensor coupled with a machine learning model for detection of fecal contamination risk in drinking water: Design, characterization and field validation,
Water Research, Volume 220, 2022, 118644.
